tetep lope biologi

LAPORAN HASIL PRAKTIKUM

BIOLOGI SEL MOLEKULER

Oleh

Yunita Rusidah

P2BA09010

UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN

FAKULTAS BIOLOGI

PROGRAM MAGISTER BIOLOGI

PURWOKERTO

2010

DAFTAR ISI

Halaman

Kata Pengantar

ACARA I. ISOLASI DNA PLASMID

ACARA II. RESTRIKSI DNA PLASMID

ACARA III. ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA

ACARA IV. TRANSFORMASI

ACARA I.

ISOLASI DNA PLASMID

LANDASAN TEORI

Plasmid adalah molekul DNA sirkuler berukuran relatif kecil di luar kromosom yang terdapat di dalam sel prokariot, khususnya bakteri. Gen-gen yang terdapat di dalam plasmid pada umumnya tidak esensial bagi pertumbuhan dan kelangsungan hidup individu bakteri, tetapi sering kali menyandi sintesis protein untuk resistensi terhadap antibiotik. Dalam rekayasa genetika plasmid sering digunakan sebagai vektor untuk membawa gen-gen tertentu yang diinginkan ke dalam suatu sel inang. Gen-gen tersebut selanjutnya akan mengekspresikan produk komersial tertentu seperti insulin, interferon, dan berbagai enzim.

TUJUAN

Melihat cara kerja isolasi DNA plasmid

BAHAN DAN ALAT

1. E. coli JM109 yang di dalamnya terdapat plasmid pUC19

2. Medium Luria Bertani (LB) agar dan LB cair

3. Ampisilin

4. QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, USA)

5. Microsentrifuga 5415D (Eppendorf)

6. Tabung mikrosentrifuga

7. Sarung tangan

8. Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific)

9. Lemari pendingin

10. Kamera Digital

CARA KERJA

DNA vektor pUC19 diisolasi menggunakan QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, USA).

1. Koloni tunggal bakteri JM transforman pUC19 dinokulasikan ke 25 ml medium LB cair dan diinkubasi di dalam shaker-incubator dengan kecepatan rotasi 150 rpm pada suhu 37^oC selama 16 jam (semalam).

2. Kultur bakteri hasil inkubasi 16 jam sebanyak 3 ml diambil dan dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifuga kemudian dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g selama 5 menit.

3. Pelet sel diresuspensi dengan 1 ml larutan STE dan disentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g selama 5 menit.

4. Pelet sel bakteri diresuspensi dengan 250 µl Buffer P1 sampai homogen.

5. Suspensi ditambah 250 µl Buffer P2 dan diresuspensi kembali dengan cara dibolak-balik sebanyak 4-6 kali.

6. Suspensi yang dihasilkan akan berubah warnanya menjadi biru.

7. Suspensi selanjutnya ditambah 350 µl N3 dan diresuspensi dengan cara yang sama sehingga warna suspensi kembali seperti warna awal.

8. Tahap selanjutnya tabung mikrosentrifuga disentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm (17,900 x g) selama 10 menit.

9. Supernatan yang dihasilkan dipindah dengan cara memipet ke dalam collection tube yang dilengkapi dengan QIAprep spin column dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 13000 rpm (17,900 x g) selama satu menit.

10. Cairan yang melewati membran dibuang dan QIAprep spin column dimasukkan kembali ke dalam tabung mikrosentrifuga.

11. QIAprep spin column dicuci dengan 500 μl PB dan disentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm selama satu menit.

12. Cairan yang melewati QIAprep spin column dibuang, dan ke dalam QIAprep spin column ditambahkan kembali 750 μl buffer PE, dan dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm selama satu menit.

13. Cairan yang melewati QIAprep spin column kembali dibuang dan disentrifugasi ulang untuk menghilangkan sisa buffer pencuci.

14. QIAprep spin column dipindahkan ke tabung mikrosentrifuga 1,5 ml baru dan ditambah dengan 50 μl buffer EB, dan dilanjutkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm selama satu menit (elusi pertama).

15. QIAprep spin column dipindahkan ke tabung mikrosentrifuga 1,5 ml yang lain dan ditambah dengan 50 μl buffer EB. Tabung mikrosentrifuga beserta QIAprep spin column disentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm selama satu menit (elusi kedua).

HASIL

Plasmid adalah molekul DNA sirkuler berukuran relatif kecil di luar kromosom yang terdapat di dalam sel prokariot, khususnya bakteri. Plasmid yang diisolasi berasal dari bakteri, proses ini dikenal sebagai mini preparation karena jumlahnya hanya sekitar 1-20µg. Sedangkan untuk jumlah yang lebih besar (100-200µg) dinamakan midi preparation dan maxi preparation untuk jumlah yang lebih besar dari 200 µg.

Inti dari isolasi plasmid bakteri adalah menghancurkan membran sel sehingga semua organel sel dapat keluar. Sehingga didapatkan DNA kromosomal serta DNA ekstrakromosmal (plasmid). Untuk memperoleh plasmid saja harus dilakukan pemurnian dari debris membran sel, organel sel dan pengotor lainnya. Metode yang digunakan untuk isolasi plasmid, yaitu boiling lysis, lysis with detergent, mechanical lysis, alkaline lysis, dan enzimatic digestion. Metode yang paling banyak digunakan dalam isolasi ini adalah metode alkaline lysis. Variasi bentuk DNA memiliki perbedaan sifat pada keadaan alkalis. DNA kromosom dan DNA plasmid dapat merenaturasi dengan membutuhkan lama waktu yang berbeda. Tahapan yang harus dilalui selama proses ini adalah resuspention, lysis, neutralization, dan clearing of lysate. Pada tahap resuspensi, pellet sel hasil dentrifuge diresuspensikan dalam buffer STE (Saline Tris EDTA) pH 8. Adanya EDTA ini berfungsi sebagai pengkelat magnesium kalsium yang berperan dalam menjaga stabilitas membran plasma. Selain itu EDTA juga menghambat DNAse sehingga molekul DNA tidak terdenaturasi. Tris Saline menjaga pH larutan sehingga DNA tetap stabil. Tahap lysis tetap menggunakan pelet hasil sentrifuge pada tahap sebelumnya. Pellet ini diresuspensikan ke dalam buffer lisis yang terdiri dari: SDS 10% untuk menghancurkan membran sel dan denaturasi protein, NaOH untuk mendenaturasi DNA dan mulai menghidrolisis RNA, enzim lisosim menghancurkan dinding sel bakteri, dan larutan glukosa untuk meningkatkan tekanan osmotik di luar sel yang mampu membantu proses pelisisan. DNA plasmid dan DNA kromosomal akan terdenaturasi dengan cara yang berbeda dengan menggunakan NaOH, karena plasmid berbentuk sirkuler maka setelah mengalami denaturasi bentuknya akan tetap utuh. DNA kromosomal yang berbentuk linier akan segera kehilangan bentuknya setelah terdenaturasi. Selanjutnya adalah tahap neutralizer, dengan menambahkan larutan penetralisir yang berisi kalium asetat dan asam asetat pada pH 5. Kegunaan dari asam asetat adalah untuk menetralkan pH sehingga pH tidak basa dan DNA bisa renaturasi. Penambahan kalium asetat akan menyebabkan renaturasi plasmid, mengendapnya single stranded DNA karena molekulnya yang besar dan tidak dapat larut dalam larutan dengan kadar garam tinggi, pembentukan KDS yang tidak larut sehingga SDS dapat dengan mudah terbuang. Yang perlu diperhatikan pada tahap ini adalah proses renaturasi pada DNA plasmid lebih cepat daripada renaturasi dari DNA kromosomal. Selain itu pada saat penambahan larutan lisis ini sebaiknya tidak digunakan vortex atau sentrifugasi yang berlebihan karena akan ikut menyebabkan DNA kromosomal menjadi lebih kecil sehingga akan terlarut pada supernatant. Kemudian masuk ke tahap clearing of lysates, pada tahap ini diperoleh supernatant yang berisi DNA plasmid. Penambahan etanol absolut berguna untuk mengendapkan plasmid karena perbedaan polaritas, etanol yang ditambahkan harus dingin agar lebih banyak lagi DNA plasmid yang mengendap. Selanjutnya untuk menghilangkan pengotor yang masih ada ditambahkan etanol 70% sehingga sisa etanol yang tersisa dapat diuapkan dengan evaporasi. Plasmid yang didapatkan berupa pellet dilarutkan kembali dengan ddH2O sehingga dapat dilakukan analisis lebih lanjut dengan menggunakan elektroforesis.

DAFTAR REFERENSI

http://www.docstoc.com/docs/16225344/isolasi-plasmid

http://ekmon-saurus.blogspot.com/2008/11/isolasi-plasmid-metode-lisis-alkali.html

http://june-s.blogspot.com/2008/05/biology-my-departement.html

ACARA II.

RESTRIKSI DNA PLASMID

LANDASAN TEORI

Teknologi DNA rekombinan merupakan suatu teknologi yang dapat diterapkan sebagai pendekatan dalam mengatasi masalah sulitnya memurnikan protein dan materi lainnya dari suatu organisme dalam jumlah besar. Salah satu teknik yang digunakan dalam teknologi DNA rekombinan adalah teknik pemotongan DNA (restriksi DNA). Molekul DNA rekombinan dapat diperoleh dengan cara memotong DNA vektor pada tempat tertentu yang memiliki daerah pemotongan yang sama dengan hasil pemotongan DNA kromosom. Manipulasi pemotongan DNA dilakukan oleh enzim yang disebut endonuklease restriksi.

Beberapa enzim seperti BamHI, EcoRI dan PstI dapat memotong masing-masing strand DNA. Molekul DNA yang dihasilkan memiliki ujung lengket yang kemudian dapat berasosiasi dengan pasangan basa komplementer pada beberapa fragmen DNA lain yang juga telah dipotong dengan enzim restriksi.

TUJUAN

Melihat cara kerja pemotongan DNA plasmid

BAHAN DAN ALAT

1. Plasmid pUC19

2. Enzim restriski (PstI)

3. Microsentrifuga 5415D (Eppendorf)

4. Tabung mikrosentrifuga

5. Sarung tangan

6. Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific)

7. pemanas air (water bath) tipe WB-20E (JEIO TECH, Korea)

8. termometer

9. Lemari pendingin (Frezer)

10. Kamera Digital

CARA KERJA

1. Vektor pUC19 dipotong dengan enzim restriksi yang sama dengan pemotongan DNA genom, yaitu enzim PstI.

2. Optimasi reaksi restriksi sebelumya dilakukan terlebih dahulu untuk memastikan DNA dapat terpotong sempurna dengan kondisi optimasi tersebut. Reaksi restriksi dipersiapkan dalam tabung mikrosentrifuga berukuran 1 ml, dengan komposisi Buffer E, BSA, DNA dan PstI

3. Reaksi restriksi dipersiapkan dalam tabung mikrosentrifuga berukuran 1 ml sesuai dengan hasil optimasi reaksi restriksi. Misalkan reaksi restriksi bekerja secara optimum dengan komposisi Buffer E sebanyak 5 µl, BSA sebayak 0,5 µl, DNA pUC19 sebayak 20 µl, dan PstI sebayak 2 µl untuk final volume 50 µl.

4. Campuran reaksi dihomogenkan sebentar menggunakan mikrosentrifuga selama 1-2 detik. Tabung mikrosentrifuga diketuk sebentar untuk memastikan campuran sudah tersuspensi.

5. Tabung mikrosentrifuga yang berisi campuran reaksi tersebut diinkubasi pada suhu 37 ⁰C selama 4 jam menggunakan pemanas air (Water Bath).

6. Tabung mikrosentrifuga selanjutnya diinkubasi pada suhu 70 ⁰C selama 10 menit menggunakan Water Bath. Hal ini dilakukan untuk inaktifasi enzim restriksi.

7. Larutan DNA hasil restriksi disimpan di dalam Frezer.

HASIL

Plasmid yang digunakan atau direstriksi dalam praktikum kali ini adalah pUC 19. Palsmid pUC 19 ini memiliki ukuran lebih kecil yaitu 2.7 Kb, DNA non genomik berbentuk sirkuler (DNA phage l berbentuk linier, dengan ukuran 48,5 Kb). Biasanya plasmid pUC 19 memiliki daerah ORI (origin of replication), dan bisa mengkopi 200+/sel. Gen resisten amphisilin dan gen Lac Z (memiliki gen lac operon), sehingga bisa mengkode ß-galaktosidase, memiliki enzim yang bisa mensintesis laktosa dari glukosa dan galaktosa.

Dalam teknik RFLP untuk analisis DNA dapat menggunakan enzim restriksi EcoRI dan HindIII karena menghasilkan sejumlah fragmen polimorfik. Karena kebanyakan molekul DNA dalam sel berukuran lebih besar dari yang diperlukan untuk analisa DNA di laboratorium.  Jika akan mempelajari gen secara individual atau mempelajari situs individual pada DNA, molekul DNA berukuran besar di dalam sel harus dipotong ke dalam fragmen-fragmen yang lebih kecil.  Pemotongan DNA ini dilakukan dengan menggunakan enzim endonuklease restriksi.  Nuklease ini adalah enzim yang memotong DNA pada tempat tertentu dengan cara mengenali urutan basa yang spesifik (Gambar 1). Enzim restriksi yang digunakan dalam biologi molekuler umumnya mengenali urutan basa yang pendek (4-8 bp) dan memotong pada posisi tertentu yang telah ditentukan dalam urutan sekuens DNA tersebut.  Contohnya adalah enzim EcoRI yang ditemukan pada strain Escherichia coli dan merupakan enzim restriksi yang pertama (I) ditemukan pada spesies ini.  Enzim ini mengenali urutan DNA 5′-GAATTC-3′.

Jika molekul DNA yang sama dipotong dengan enzim restriksi yang berbeda, misalnya oleh HindIII yang mengenali urutan  6pb (5′-AAGCTT-3′), atau dipotong dengan EcoRI, maka molekul DNA dipotong pada posisi yang berbeda dan menghasilkan fragmen dengan ukuran yang berbeda (Gambar 2).  Jadi sebuah molekul akan menghasilkan sebuah seri karakteristik pola pemotongan DNA saat dipotong dengan satu set enzim restriksi yang berbeda.

Enzim restriksi tidak hanya berbeda dalam urutan basa yang dikenali, tetapi juga pada pada struktur hasil produk pemotongannya.  Beberapa enzim seperti HpaI menghasilkan produk dengan ujung tumpul, enzim lain seperti EcoRI, HindIII dan PstI menghasilkan ujung lengket

DAFTAR REFERENSI

http://karya-ilmiah.um.ac.id/index.php/disertasi/article/view/1045

http://www.fp.unud.ac.id/biotek/biologi-sel/teknik-molekuler/

http://biomol.edublogs.org/kompetensi/bahan-ajar/3-enzim/

ACARA III.

ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA

LANDASAN TEORI

Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa digunakan antara lain agarosa. Elektroforesis gel agarosa dapat dilakukan untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (bp).

Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan memsumuraningkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-fragmen molekul DNA standar (DNA marker) yang telah diketahui ukurannya. Visulisasi DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar ultraviolet setelah terlebih dahulu gel dalam pembuatannya ditambahkan larutan etidium bromid. Cara lain untuk melihat visualisasi DNA adalah gel direndam di dalam larutan etidium bromid sebelum dipaparkan di atas sinar ultraviolet.

Teknik gel elektroforesis makin berkembang dan disempurnakan, hingga 12 tahun kemudian ditemukan gel poliakrilamida (PAGE = Polyacrilamide Gel Electrophoresis) yang terbentuk melalui proses polimerisasi akrilamida dan bis-akrilamida. PAGE ini sanggup memisahkan campuran DNA/RNA atau protein dengan ukuran lebih besar. Meskipun aplikasi elektroforesis makin berkembang luas, namun ternyata teknik ini masih menyerah jika digunakan untuk memisahkan DNA dengan ukuran yang super besar, misalnya DNA kromosom. Campuran DNA kromosom tidak dapat dipisahkan meskipun ukuran mereka berbeda-beda.

TUJUAN

Melihat cara kerja elektroforesis gel agarosa

BAHAN DAN ALAT

1. DNA marker, misalnya DNA λ yang dipotong dengan HindIII

2. Sampel DNA, misalnya NA kromosom bakter, DNA plasmid hasil isolasi (uncut), DNA plasmid hasil restriksi (cut)

3. Agarosa

4. Larutan buffer TAE 50x (242 g tris-base; 57,1 g asam asetat glacial; 100 ml EDTA 0,5 M pH 8; dilarutkan dalam akuades hingga 1000 ml)

5. Akuades

6. Gelas Ukur 1000 ml

7. Labu Erlenmeyer 50 ml

8. Tabung mikrosentrifuga

9. Sarung tangan

10. Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific)

11. Kertas parafilm

12. Seperangkat alat elektroforesis

13. Loading dye 6x (0,25% bromophenol blue; 0,25% xylene cyalol; 15% ficoll tipe 4000; EDTA 120 mM)

14. Larutan Etidium Bromid (EtBr)

15. UV transluminator dan kamera digital

CARA KERJA

1. Buat 250 ml larutan buffer TAE 1x dengan cara mencamnpurkan 5 ml TAE 50x ke dalam 245 ml akuades.

2. Buat gel agarosa 1% dengan cara menimbang agarosa 0,2 g untuk dilarutkan ke dalam bufer TAE 1x hingga volume 20 ml. Larutan agarosa dididihkan hingga larut sempurna.

3. Siapkan baki gel agarosa, lekatkan selotip di tiap ujung baki gel agarosa (pastikan bahwa selotip melekat kuat dan tidak ada lubang pada masing-masing ujung baki)

4. Pasang sisir elektroforesis di salah satu ujung baki gel agarosa dengan posisi hampir menyentuh dasar baki

5. Periksalah suhu larutan agarosa dengan cara menempelkan erlenmeyer ke tangan, jika suhunya sudah turun hingga sekitar 50-60 ⁰C, tambahkan 1 µl etidium bromid (PERINGATAN KERAS!!, gunakan sarung tangan karena bersifat karsinogenik).

6. Larutan agarosa dihomogenkan sebentar, kemudian tuangkan larutan ke dalam baki gel agarosa, biarkan hingga larutan berubah menjadi gel yang padat.

7. Ambil sisir dengan hati-hati, lepaskan selotip dari ujung-ujung baki.

8. Masukkan baki yang telah berisi gel agarosa ke dalam tangki elektroforesis yang telah diisi dengan larutan bufer TAE 1x (pastikan bahwa gel terendam seluruhnya dalam TAE).

9. Siapkan sekitar 5 cm kertas parafilm di dekat tangki elektroforesis.

10. Masukkan 10 µl sampel DNA dan 2 µl loading dye 6x ke dalam sumuran gel agarosa dengan cara mencampurkan kedua bahan tersebut terlebih dahulu secara merata pada kertas parafilm menggunakan mikropipet.

11. Buatlah catatan mengenai nomor sumuran dan jenis sampel DNA yang dimasukkan.

12. Hubungkan kabel dari sumber arus ke tangki elektroforesis (pastikan bahwa kabel yang tersambung ke kutub negatif berada di dekat sumuran; jika tidak demikian, ubahlah posisi baki/gel ke arah sebaliknya).

13. Nyalakan sumber arus, aturlah volatase dan waktu running hingga diperoleh angka 70 V dan 45 menit dengan cara menekan tombol yang sesuai pada sumber arus.

14. Jalankan elektroforesis (lakukan running) dengan cara menekan tombol run pada sumber arus.

15. Elektroforesis akan berhenti apabila waktu yang ditetapkan sudah habis, yang ditandai oleh adanya bunyi alarm. Matikan sumber arus dan angkatlah baki dari tangki elektroforesis.

16. Keluarkan gel dan letakkan di atas UV transluminator (letakkan selubung kaca hitam di atas UV transluminator).

17. Nyalakan UV transluminator, amati pita-pita DNA yang tervisualisasi.

HASIL

Gambarlah pita-pita dna hasil elektroforesis dengan nomor sumuran dan jenis sampelnya. Perkirakan ukuran masing-masing fragmen/pita dengan memsumuraningkannya dengan posisi migrasi pada DNA marker.

Keterangan:

1 = Marka (λ/hind III)

2 = K1 (pUC + HindIII)

3 = K2 (pUC + E. Cory I)

4 = K3 (pUC + Pst I)

5 = K4 (pUC + E. Cory I)

6 = A1 (pUC + E Cory I)

7 = A2 (pUC + Pst I)

8 = A3 (pUC + HindIII)

9 = A4 (pUC)

10 = K1 (pUC hasil isolasi)

11 = K2 (pUC hasil isolasi)

base pairs (bp)	distance(mm)	log 10 bp	distance unknow	m*distance	y value	unknow bp value
23130	13	4.364176	36	-0.972	3.711	5140.436516
9416	25	3.973866	35	-0.945	3.738	5470.159629
6557	30	3.816705	33	-0.891	3.792	6194.410751
4361	40	3.639586	35	-0.945	3.738	5470.159629
			43	-1.161	3.522	3326.595533
			32	-0.864	3.819	6591.738952
			35	-0.945	3.738	5470.159629
			44	-1.188	3.495	3126.079367
			45	-1.215	3.468	2937.649652
			43	-1.161	3.522	3326.59553

Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen/molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik (Westermeier, 2004). Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Dengan demikian elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat). Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi, atau pun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer. Elektroforesis dapat digunakan untuk mengetahui ukuran DNA dengan menggunakan DNA marker yang sudah diketahui ukurannya. DNA marker ini berfungsi sebagai pemsumuraning sehingga bisa diketahui perkiraan ukuran DNA sampel.

Berdasarkan hasil praktikum tersebut persamaan regresi logaritmik yang digunakan untuk DNA marker data yang diperoleh: y = -0,027x+4,683; R2 = 0,977 Persamaan logaritmik menghasilkan nilai R2 yang paling mendekati 1. Dengan menggunakan persamaan ini dapat ditentukan ukuran DNA sampel berdasarkan jarak migrasinya:

NO	SUMURAN	distance unknow	unknow bp value
1.	Marka (DNA λ/Hind III)
2.	K1 (pUC + HindIII)	36	5140.436516
3.	K2 (pUC + E. Cory I)	35	5470.159629
4.	K3 (pUC + Pst I)	33	6194.410751
5.	K4 (pUC + E. Cory I)	35	5470.159629
6.	A1 (pUC + E Cory I)	43	3326.595533
7.	A2 (pUC + Pst I)	32	6591.738952
8.	A3 (pUC + HindIII)	35	5470.159629
9.	A4 (pUC)	44	3126.079367
10.	K1 (pUC hasil isolasi)	45	2937.649652
11.	K2 (pUC hasil isolasi)	43	3326.595533

Hasil praktikum pada umumnya menunjukkan adanya kesingkronan dengan ukuran dan jarak migrasi DNA marker. Namun ada yang menunjukkan kejanggalan yaitu pada sumuran ke 10 pita DNA tidak jelas sehingga tidak dapat di pengukuran dan perhitungan jarak migrasi dari DNA kurang tepat. Hal ini dimungkinkan saat meletakkan DNA pUC hasil isolasi tidak berada tepat pada sumuran sehingga hasil elektroforesisnya tidak terlihat dengan jelas. Selain itu yang menyebabkan kejanggalan ini adalah perhitungan jarak migrasi dari DNA marker yang kurang tepat karena adanya pita smear atau pita yang tertumpuk sehingga sulit untuk diketahui jarak migrasi pastinya.. Migrasi DNA saat elektroforesis tergantung pada ukuran dan bentuk DNA maka bentuk dari DNA sampel dapat diperkirakan berdasarkan jarak migrasinya. Untuk plasmid yang sama diperoleh lebih dari satu ukuran karena adanya DNA lain, seperti DNA kromosomal dan DNA mitokondria yang bisa saja terikut dalam elektroforesis selain DNA plasmid sehingga diperoleh berbegai macam ukuran DNA. Bentuk DNA plasmid yang diperoleh juga bervariasi, kemungkinan penyebabnya adalah proses renaturasi plasmid yang tidak sempurna sehingga tidak dapat berbentuk sirkular seperti normalnya atau bahkan plasmid tersebut terdenaturasi karena goncangan yang terlalu kencang saat proses isolasi.

Hampir semua sumuran menunjukkan adanya RNA karena sumuran yang ditunjukkan berupa smear dan kurang jelas yang merupakan ciri dari RNA saat elektroforesis. Hanya pita no 5 dan 8 saja yang terlihat jelas tanpa adanya smear. Bentuk DNA (plasmid) yang paling cepat termigrasikan menuju kutub positif adalah DNA dengan bentuk supercoiled, disusul oleh DNA plasmid bentuk supercoiled terdenaturasi, relaxed circular, linear, dan nicked open circular. Hal yang dapat menyebabkan tertumpuknya sumuran ini beragam, mulai dari DNA sampel itu sendiri serta proses elektroforesis yang dilakukan. DNA plasmid yang digunakan untuk proses elektroforesis ini tidak dapat dijamin 100% kemurniannya karena selain DNA plasmid dalam bakeri juga terdapat DNA lain yang mungkin saja terikut, misalnya, pada proses penetralan jika sentrifugasi dan pengocokan dilakukan berlebihan atau terlalu kuat maka DNA kromosomal dapat terlarut dalam supernatant bersama DNA plasmid yang digunakan untuk tahap selanjutnya.

Dalam praktikum kali ini menggunakan gel agarose, karena pada memiliki power lebih rendah namun memiliki laju pemisahan lebih cepat, dapat memisahkan fragmen DNA antara 100bp – 50kb tergantung dari konsentrasi gel agarose yang digunakan dan memiliki medan gerak biasanya horizontal. Untuk mendeteksi potongan-potongan DNA berupa bands-DNA pada gel agarose digunakan pewarna yang mengandung fluoresen dengan konsentrasi rendah, seperti intercalating agent ethidium bromide (EtBr). Hanya sedikit DNA  1ng dapat dideteksi secara langsung dengan cara gel diletakkan pada media UV-transilluminator. EtBr ini akan mengikat pada sela-sela pasangan basa DNA. EtBr dapat mengurangi mobilitas DNA linier sampai 15%. EtBr dapat digunakan untuk mendeteksi single- atau double-stranded asam nukleat (DNA atau RNA). Meskipun, affinity dari EtBr-dye ini untuk single-stranded asam nukleat relative rendah dan pendaran fluorensen minimum.

Protein marker digunakan untuk mengidentifikasi berat molekul dari campuran polypeptida. Marker protein yang digunakan memiliki rentang berat molekul 212 kDa- 11,3 kDa. Dari hasil elektroforesis terdapat sejumlah pita protein yang memiliki ketebalan berbeda-beda. Dalam proses elektroforesis itu sendiri banyak hal yang mempengaruhi migrasi DNA, yaitu: ukuran DNA, konsentrasi agarosa, konformasi DNA, tegangan arus listrik, arah medan listrik, temperatur, keberadaan interchelating agent, komposisi basa, dan komposisi buffer elektroforesis.

DAFTAR REFERENSI

http://www.fp.unud.ac.id/biotek/biologi-sel/teknik-molekuler/

http://www.docstoc.com/docs/16225344/isolasi-plasmid

http://sutikno.blog.uns.ac.id/2009/06/19/elektroforesis/

http://images.google.com/images?sourceid=navclient&q=supercoiled%20dna%20plasmid&um=1&ie=UTF-8&sa=N&hl=id&tab=wi

http://www.eupertstrain.org

http://sciencebiotech.net/elektroforesis-pintu-gerbang-penelitian-biologi-molekular/

http://dewi-web.blogspot.com/2007/12/elektroforesis-gel.html

http://pasca.uns.ac.id/wp-content/uploads/2009/02/suranto-ekspresi-protein.pdf

ACARA IV.

TRANSFORMASI

LANDASAN TEORI

Transformasi merupakan teknik transfer molekul DNA ke dalam sel inang bakteri misalnya bakteri E.coli. Fenotif Strain E. coli hasil transforman akan berubah karena mendapatkan gen-gen penyandi baru yang dibawa oleh molekul DNA tersebut. Molekul DNA ini biasanya dikemas dalam suatu vektor, misalnya plasmid.

BAHAN ADAN ALAT

1. Strain E. coli JM 109

2. Media LB cair

3. Media cawan LB ampisilin dan media cawan LB tanpa ampisilin

4. Media cawan LB/Amp/X-Gal/IPTG

5. Es batu

6. Shaker-incubator

7. Tabung mikrosentrifuga

8. Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific)

9. Microsentrifuga 5415D (Eppendorf)

10. Pemanas air (water bath) tipe WB-20E (JEIO TECH, Korea)

11. Jarum ose

12. Batang drugalsky

13. Cawan Petri

14. Erlenmeyer

15. Shaker-incubator tipe EFM-60 (Seiwa Rico, Ltd.)

16. Kamera digital.

CARA KERJA

1. Kultur semalam strain E. coli JM 109 dikultivasi ke media LB cair 25 ml dengan cara memindahkan satu koloni strain E. coli JM 109 ke media LB cair. Inkubasi di dalam shaker-incubator dengan kecepatan rotasi 125 rpm pada suhu 37^oC selama 16 jam (semalam).

2. Pindahkan kultur E. coli JM 109 hasil inkubasi semalam ke media LB cair 25 ml dengan cara mengambil 250 μl kultur E. coli JM 109 ke dalam media LB cair 25 ml, atau dengan kata lain persumuraningan antara volume media dan volume kultur 10:1, kemudian dilakukan inkubasi dalam shaker-incubator dengan kecepatan rotasi 125 rpm selama 120 menit (2 jam) pada suhu 37^oC.

3. Sebanyak 1,5 ml kultur hasil inkubasi 2 jam diambil dan dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifuga dan dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g selama 5 menit.

4. Supernatan yang dihasilkan dibuang dan ke dalam tabung ditambahkan 500 μl CaCl2 dingin, diresuspensi kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g selama 5 menit.

5. Supernatan dibuang kembali dan ke dalam tabung ditambahkan kembali 200 μl CaCl2 dingin, diresuspensi dan diinkubasi dalam es. Dalam perlakuan ini terdapat lima tabung mikrosentrifuga, dua diantaranya untuk inkubasi 2 jam dan 3 lainnya untuk inkubasi 16 jam.

6. Tabung mikrosentrifuga hasil inkubasi 2 jam yang masing-masing berisi 200 μl sel kompeten, salah satunya atau tabung nomor 1 ditambah dengan 10 μl palsmid pUC19 sirkuler, sedangkan tabung nomor 2 tidak ditambah dengan palsmid.

7. Kedua tabung diinkubasi lebih lanjut dalam es selama 20 menit, kemudian diberi kejut panas (heat-shock) selama 90 detik dengan suhu 42^oC dan segera dipindahkan ke dalam es untuk diinkubasi kembali selama 10 menit.

8. Tabung mikrosentrifuga ditambahkan media LB hingga 1 ml setelah inkubasi 10 menit, dilanjutkan dengan inkubasi dalam shaker-incubator pada suhu 37^oC dengan kecepatan rotasi 150 rpm selama 1,5 jam.

9. Sebanyak 100 μl hasil inkubasi ditumbuhkan dengan cara plating ke media cawan LB/Amp untuk kedua tabung. Selain itu, sebanyak 50 μl hasil inkubasi pada tabung nomor 2 ditumbuhkan juga pada media LB tanpa ampisilin. Inkubasi dilakukan selama 16 jam pada suhu 37^oC.

10. Sementara itu, ke dalam tabung mikrosentrifuga hasil inkubasi 16 jam yang masing-masing berisi 200 μl sel kompeten, ditambahkan 10 μl vektor pUC19 sirkuler untuk penentuan efisiensi transformasi (tabung nomor 3), 2 μl vektor pUC19 rekombinan (tabung nomor 4) dan tidak ditambahkan apapun (tabung nomor 5).

11. Ketiga tabung mikrosentrifuga diinkubasi lebih lanjut dalam es selama 20 menit dan diberi kejut panas (heat-shock) selama 90 detik pada suhu 42^oC dan segera dipindahkan ke es untuk diinkubasi kembali selama 10 menit.

12. Tabung mikrosentrifuga selanjutnya ditambahkan dengan media LB hingga 1 ml, dilanjutkan dengan inkubasi dalam shaker-incubator selama 1,5 jam pada suhu 37^oC.

13. Disiapkan media cawan LB/Amp/X-Gal/IPTG dengan cara menambahkan 50 μl X-Gal dan 100 μl IPTG ke media cawan LB/Amp, lalu diinkubasi pada suhu 37^oC selama lebih kurang 30 menit.

14. Hasil inkubasi tabung nomor 3 ditumbuhkan dengan cara plating ke media cawan LB/Amp/X-Gal/IPTG sebanyak 100 μl.

15. Tabung nomor 4 disentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g selama 5 menit. Supernatan dibuang hingga tersisa 100 μl, dan kemudian ditumbuhkan dengan cara plating ke media LB/Amp/X-Gal/IPTG.

16. Hasil inkubasi pada tabung no.5 ditumbuhkan dengan cara plating ke media cawan LB/Amp sebanyak 100 μl dan ke media cawan LB sebanyak 50 μl, dilanjutkan dengan inkubasi selama 16 jam pada suhu 37^oC.

17. Untuk cawan yang berisi E. coli dengan pUC19 sirkuler dilakukan penjumlahan koloni untuk diketahui efisiensi transformasinya.

18. Efisiensi transformasi dihitung dengan cara sebagai berikut

Dimana,

Σkoloni = jumlah koloni putih (dalam cfu)

[pUC19] = konsentrasi pUC19 (dalam ng)

HASIL

Tahap berikutnya dalam eksperimen pengklonan gen setelah molekul DNA rekombinan berhasil dikonstruksi adalah memasukkan molekul DNA rekombinan tersebut ke dalam sel hidup yang disebut sel inang. Sel inang yang paling umum digunakan adalah Escherichia coli.. Karena sel dalam E.coli tergolong tidak efisien dalam menyerap DNA. Sel ini memiliki kemampuan alami menyerap DNA asing yang rendah. Kemampuan sel dalam menyerap DNA dapat ditingkatkan dengan perlakuan khusus, sehingga sel tersebut menjadi kompeten.

Sel kompeten adalah sel yang dapat menyerap DNA karena telah mendapat perlakuan fisik maupun kimia. Sel dapat dibuat kompeten melalui perlakuan dengan garam kalsium klorida (CaCl₂). Fungsi penambahan CaCl₂ pada pembuatan sel kompeten mempengaruhi dinding sel dan mungkin berperan dalam pengikatan DNA pada permukaan sel. Penyerapan DNA secara nyata sebenarnya dipengaruhi oleh perlakuan kejut panas. Sel E.coli yang kompeten diberi perlakuan kejut panas untuk membuka pori pada dinding sel bakteri. Inkubasi dengan plasmid akan menyebabkan masuknya plasmid ke dalam sel. Penambahan media LB setelah perlakuan kejut panas berfungsi untuk memenuhi kebutuhan nutrisi dari bakteri setelah mengalami perlakuan yang ekstrem.

Pemasukkan molekul DNA rekombinan ke dalam sel inang disebut transformasi apabila vektor yang digunakan berupa plasmid. Peristiwa ini disebut transformasi karena plasmid dapat mengubah sifat sel inang. Keberhasilan plasmid masuk dan bertahan di dalam sel umumnya dideteksi berdasarkan ekspresi gen marka yang dibawa oleh plasmid tersebut.

Plasmid pUC 19 adalah salah satu vektor plasmid yang sering digunakan dalam biologi molekuler. Plasmid ini mempunyai besar 2,69 kb, jumlah kopi sekitar 500-7000 dan mempunyai peta retriksi.

Plasmid pUC19 mempunyai gen penanda, yaitu gen penyandi resisten terhadap ampisilin. Gen penanda tersebut akan mengeksploitasi enzim beta-laktamase ke plasma sel bakteri inang. Enzim tersebut akan mengkatalisa hidrolisis cincin betalaktam, sehinggga menyebabkan bakteri hasil transformasi dengan pUC19 menjadi resisten terhadap ampisilin. Sel inang yang telah mengandung DNA rekombinan dibiakkan dalam medium padat, sehingga membentuk koloni. Koloni yang terbentuk merupakan sekumpulan sel yang identik karena hasil pembiakan sebuah sel. Koloni yang dapat tumbuh pada media seleksi ini adalah koloni yang berasal dari bakteri transforman saja.

Hasil praktikum transformasi yang telah dilakukan tersaji dalam plate seperti berikut:

Hasil tersebut menunjukkan pada pUC yang ditambah LB amphisilin (LB-Amp), setelah dilakukan penghitungan menghasilkan 274 koloni, sedangkan pada pUC LB Non-Amp koloni terlalu banyak (TBUD). Pada Non-pUC LB non-Amp hasilnya juga terdapat banyak koloni (TBUD). Hasil transformasi yang tidak benar terjadi pada hasil Non-pUC LB-Amp yang seharusnya kosong, namun hasil yang didapat dari praktikum kita terdapat kontaminan. Hal ini dimungkinkan amphisilin telah rusak, karena kepanasan, atau mungkin disebabkan karena dalam berkerja kurang aseptis atau kurang steril. Pada cawan sampel terjadi pertumbuhan bakteri E.coli transforman yang telah membentuk koloni tunggal. Transformasi antara sel yang kompeten dapat terjadi saat bakteri ditumbuhkan dalam media dan dapat menyebabkan kesalahan pada perhitungan laju transformasi. Hal ini dapat diperbaiki dengan penambahan EDTA pada media seleksi.

Bakteri ditumbuhkan pada medium yang mengandung ampisilin. Dengan adanya ampisilin, maka sel E. coli yang dapat tumbuh hanya sel transforman atau sel yang telah memasukkan plasmid. Inkubasi selama 18 jam akan menumbuhkan koloni bakteri yang berasal dari sel tunggal. Semua bakteri yang tumbuh dalam koloni tersebut akan memiliki sifat yang sama sebagai bakteri transforman.

Pada dasarnya ada tiga kemungkinan yang dapat terjadi setelah transformasi dilakukan, yaitu (1) sel inang tidak dimasuki DNA apa pun atau berarti transformasi gagal, (2) sel inang dimasuki vektor religasi atau berarti ligasi gagal, dan (3) sel inang dimasuki vektor rekombinan dengan/tanpa fragmen sisipan atau gen yang diinginkan. Untuk membedakan antara kemungkinan pertama dan kedua dilihat perubahan sifat yang terjadi pada sel inang. Jika sel inang memperlihatkan dua sifat marker vektor, maka dapat dipastikan bahwa kemungkinan kedualah yang terjadi. Selanjutnya, untuk membedakan antara kemungkinan kedua dan ketiga dilihat pula perubahan sifat yang terjadi pada sel inang. Jika sel inang hanya memperlihatkan salah satu sifat di antara kedua marker vektor, maka dapat dipastikan bahwa kemungkinan ketigalah yang terjadi.

Peningkatan efisiensi transformasi dapat dilakukan dengan modifikasi metode standar CaCl₂. Konsentrasi optimum CaCl₂ adalah 75 mM. Sel kompeten yang disimpan dalan -20^oC dapat bertahan hingga 7 hari, sementara penyimpanan pada -70^oC dapat bertahan hingga 15 hari. Media LB diganti dengan media SOC yang berisi tripton, ekstrak ragi, NaCl, MgCl₂, MgSO₄, dan glukosa. Media ini mendukung pertumbuhan transforman yang lebih cepat. Sementara itu, pada saat transformasi dengan plasmid ditambahkan DMSO dan PEG₈₀₀₀. Penambahan ini mampu meningkatkan efisiensi transformasi antara 100-300 kali lipat.

DAFTAR REFERENSI

http://journal.ui.ac.id/upload/artikel/Transformasi%20fragmen_Mangunwardoyo.pdf

http://afie.staff.uns.ac.id/2008/12/11/transformasi-plasmid-dna-sel-kompeten-metode-cacl2/

http://etd.eprints.ums.ac.id/2340/1/K100040214.pdf

http://meckzozp.blogspot.com/2009/01/dasar-dasar-teknologi-dna-rekombinan.html

http://www.bioline.org.br/abstract?id=ej05013&lang=en

http://joelnaga.blogspot.com/2009/12/pembuatan-sel-kompeten-dan-transformasi.html

http://digilib.itb.ac.id/gdl.php?mod=browse&op=read&id=jbptitbpp-gdl-ramlansila-28087

Lampiran 1. Peta Restriksi DNA pUC19

• Leave a comment... (0)